材料:
血源:新鲜人胎盘血由天津协和干细胞基因工程公司提供。
试剂:谷胱甘肽(GSH)(北京鼎国);电泳低相对分子质量标准品(Amersham Biosciences);高纯氮(天津华鑫);其余试剂均为国产分析纯。
方法:
人脐血血红蛋白的分离纯化:
洗血:取适量脐血,4 ℃低温离心,分离含有白细胞、血浆蛋白和血小板的上清液。下层红细胞沉淀用适量生理盐水洗涤,离心挤出上层洗涤液,剩余下层压积红细胞,重复上述洗涤步骤3次,以最大限度除去红细胞外的其他物质,得到洁净压积红细胞。
破膜:在上述压积红细胞中加入适量pH 7.4的低渗磷酸盐缓冲液(预先通高纯氮脱除氧气),混匀破膜。过程中持续通氮。
破膜的终止:破膜15 min后加入30%NaCl至NaCl终浓度为0.9%。
加热前处理:加入3%Vc调pH=6.0;加入50%葡萄糖至其终浓度为3%,混匀,充分通氮脱氧30 min。
纯化:向上述处理好的血红蛋白溶液中按体积比0.5%加入180 ℃,4 h烤过的无热原活性炭,对照组于55 ℃水浴加热,待血红蛋白溶液温度达到(55±1) ℃开始计时,2 h后加热处理完成,对照组是实验室经过验证后对血红蛋白的理化性质及生物学功能没有影响的、目前正在使用的一种热敏法纯化血红蛋白的方法;巴氏消毒组于 60 ℃水浴加热,待血红蛋白溶液温度达到(60±1) ℃开始计时,10 h后加热处理完成,该过程持续通氮保护。
加热后处理:上述混合液体通氮保护条件下置冰浴冷却到 4 ℃以下,4 ℃低温高速离心,上清液经 0.45 µm微孔滤膜过滤,滤液用截留相对分子质量10 000的超滤膜超滤浓缩,超滤液再通过 0.22 µm的滤膜,完成除菌过滤,得到纯化及病毒灭活的脐带血血红蛋白。4 ℃冰箱中保存备用。
检测方法:
血红蛋白浓度测定:采用HiCN法测定。
高铁血红蛋白(MetHb)含量测定:采用分光光度法测定。
血红蛋白纯度测定:①采用12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定[5]。②采用HPLC分析法测定[6]。HPLC分析采用凝胶柱 SuperdexTM 75 (10 mm×300 mm),流动相:1/15M PBS (pH7.3),流速:0.5 mL/min,柱温:25 ℃,检测波长:280 nm。
携氧量及P50测定:按文献[7]法测定。测定条件:生理盐水透析,血红蛋白的浓度6.5%-7%。
光谱分析:扫描波长为200-1 000 nm,血红蛋白浓度0.05 g/L[8]。